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5. Anhang

5.1 Äsculin-Blutagar
Beispiele für das Basismedium zur Herstellung des Äsculin-Blutagars:

Grundsätzlich können auch andere Basismedien verwendet werden, die sich bei Kontroll-untersuchungen als für diesen Zweck geeignet erwiesen haben.

Zur Herstellung des Blutagars kann Schafblut oder Rinderblut, vorzugsweise Kälberblut, Verwendung finden. Staphylokokken-Antihämotoxine, die im Blut bestimmter Tiere vorhanden sind, können die a- oder b- Hämotoxine von S. aureus neutralisieren. Daher muß jede Blutcharge mit einem hauseigenen Kontrollstamm von S. aureus geprüft werden, der eine 4 - 6 mm breite Zone einer unvollständigen Hämolyse bildet. Ein weiterer Kontrollstamm soll eine abgegrenzte Zone einer vollständigen Hämolyse bewirken.

Blutentnahme und -präparation:
Das Blut muß unter antiseptischen Bedingungen von gesunden Tieren gewonnen werden. Die Haut über der Vene wird durch Entfernen der Haare, Reinigung mit Alkohol und Jodieren vorbereitet. Das Blut kann in ein Vakuumgefäß abgezogen werden. Das Blut muß bei der Entnahme ungerinnbar gemacht werden.
Dies kann erfolgen durch

• Schütteln mit Glasperlen, die vorher im Entnahmegefäß sterilisiert wurden (defibriniertes Blut)
  

• Zusatz von Gerinnungshemmern

Die Behälter sollten groß genug sein, um 600 ml aufzunehmen. Der sterile Container soll 30 ml einer sterilen 10 %igen Natriumcitratlösung enthalten. Er wird mit Blut bis auf die 600 ml-Marke aufgefüllt (Aufbewahrung im Kühlschrank). Anstatt 10 % Natriumcitrat kann ein Antikoagulans der folgenden Zusammensetzung Verwendung finden:

0,8 g di-Kaliumoxalat


1,2 g di-Ammoniumoxalat


in 100 ml Aqua dest. lösen.

 

Dieses Gemisch ca. 1 Tag bis zur vollständigen Auflösung stehen lassen und autoklavieren (15 Min. bei 121° ± 1°C).
Verhältnis Antikoagulans : Blut = 1 : 10

Alternativ kann auch verwendet werden:

29,0 g Citronensäure


80,0 g Tri-Natriumcitrat


180,0 g D(+)-Glucose


840,0 ml A.dest.

Die Lösung wird 15 Min. bei 121 ±1°C autoklaviert. Verhältnis Antikoagulans : Blut = 30 : 570

Vorbereitung des Blutes zur Nährbodenherstellung:
Zur Verwendung des Blutes für die Nährböden kann ein Waschen der roten Blutkörperchen erforderlich sein (3 Waschvorgänge).
Sterile Zentrifugengläser werden jeweils mit der gleichen Menge Blut beschickt und 10 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand mit einer sterilen Pipette abgesaugt, in einen sterilen Glaskolben gegeben und - je nach Bedarf - im Kühlschrank oder in kleinen Portionen abgefüllt tiefgefroren (< -18°C) aufbewahrt. Die Blutkörperchen (Sediment) füllt man mit einer sterilen 0,9 %igen Kochsalzlösung bis zur ursprünglich vorhandenen Menge auf.
Anschließend wird erneut zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und das Sediment wieder mit physiologischer Kochsalzlösung aufgefüllt (2. Waschvorgang.).
Danach muß nochmals zentrifugiert, der Überstand abpipettiert und das Sediment wiederum mit physiologischer Kochsalzlösung aufgefüllt werden (3. Waschvorgang).
Das Gemisch aus Blutkörperchen und Kochsalzlösung wird in sterile Glaskolben abgefüllt, gut geschüttelt und kann bis zu 1 - 2 Wochen im Kühlschrank aufbewahrt werden.

Zu 100 ml des sterilen und auf 50°C abgekühlten Basismediums werden 5 bis 10 ml defibrinierten Blutes bzw. der gewaschenen Blutkörperchen zugefügt. 8 bis 10 ml dieses Mediums werden in eine 9 bis 10 cm im Durchmesser betragende Petrischale gegeben. Um die Stabilität des Blutagars zu verbessern, kann der Salzgehalt im Basismedium auf 10 g/l erhöht werden.

5.2 Anreicherungen
Grundsätzlich können auch andere Anreicherungsmedien verwendet werden, die sich bei Kontrolluntersuchungen als für diesen Zweck geeignet erwiesen haben.

5.3 Spezialnährmedien
Die nachfolgend aufgeführten Spezialnährmedien stellen Beispiele dar. Grundsätzlich können jedoch auch hier andere Kulturmedien verwendet werden, die sich bei Kontrolluntersuchungen als für diesen Zweck geeignet erwiesen haben.

5.3.1 Staphylokokken
P-Agar (modifiziert)

Standard-I-Agar (Merck^â)


+ 7µg Acriflavin/ml Medium

5.3.2 Streptokokken

TKT-Agar
Siehe EDWARDS Medium, vervollständigt durch Zugabe von 2 bis 3 % S. aureus-b-Toxin (Präparation des b-Toxins: Anzüchtung eines b-toxinproduzierenden S. aureus-Stammes in Nährbouillon mit 0,1 % Glucose und 0,1 % Agar in 80 %iger CO₂ - und 20 %iger O₂ - Atmosphäre für die Dauer von 8 Tagen. Erhitzen auf 80°C. Zentrifugieren und Sterifiltration. Chemische Konservierung bis zu 5 Jahre ist möglich. Jede Charge muß vor Verwendung getestet werden).

Neomycin-Staphylokokkentoxin-Blutagar
Dem Basismedium (5 – 10 % Blutagar) werden auf 1 l

1 g Äsculin


30 - 40 ml Staphylococcus aureus-b-Toxin (s. o.)


750 IE Neomycinsulfat hinzugesetzt.

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